標(biāo)記大腸桿菌

微生物細胞表面表達的蛋白質(zhì)可用于各種應(yīng)用并對其進行操作。它們已被證明在廣泛的領(lǐng)域非常有用，包括蛋白質(zhì)工程、抗體片段篩選、全細胞催化劑、生物修復(fù)吸附劑等 。然而，一個主要的限制是只有 20 種天然存在的氨基酸。如果可以擴展表達的氨基酸組或用合成衍生物專門替換某些氨基酸，則可以進一步操縱表面蛋白，潛在應(yīng)用的數(shù)量將呈指數(shù)增加。在這個方向上，一些研究小組已經(jīng)取得了顯著的成功。

利用 HDC 反應(yīng)的高可靠性，Link 和 Tirrell 將一種含疊氮化物的合成氨基酸摻入大腸桿菌的表面蛋白質(zhì)中 。他們選擇的氨基酸是疊氮高丙氨酸 (AHA)。之前已經(jīng)表明 AHA 可以替代蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基  并且大腸桿菌的外膜蛋白 C (OmpC) 包含三個這樣的殘基。還創(chuàng)建了每個 OmpC 含有九個甲硫氨酸殘基的突變大腸桿菌用于比較。一旦 AHA 被納入 OmpC 中，使用生物素化炔試劑進行點擊反應(yīng)。兩種細胞都被成功地生物素化，但只有突變的大腸桿菌會與大分子抗生物素蛋白結(jié)合，這可能是由于額外的甲硫氨酸殘基周圍的空間擁擠較少。

標(biāo)記 DNA

寡核苷酸代表了一類非常重要的生物分子。盡管過去由于缺乏知識，它們一直被制藥界“回避"，但它們最近發(fā)現(xiàn)了許多應(yīng)用，并被認(rèn)為是許多研究領(lǐng)域最重要的工具。它們已被用于基因治療、作為治療白血病等疾病的反義劑、作為分子探針  等。添加不同的官能團進一步增加了它們的多功能性，特別是當(dāng)人們認(rèn)為可以引入功能化時在 3' 端、5' 端或內(nèi)部位置。新添加的官能團可以作為與各種生物分子進行生物偶聯(lián)的手柄。然而，目前用于 DNA 生物偶聯(lián)的方法效率低下。該程序必須能夠耐受水性條件，產(chǎn)生高產(chǎn)率，并且由此產(chǎn)生的連接必須在生物條件下穩(wěn)定。這是點擊化學(xué)的理想情況。

利用 HDC 反應(yīng)，Seo 等人。能夠?qū)晒鈭F標(biāo)記到單鏈 DNA 的 5' 末端 。寡核苷酸經(jīng)過多次反應(yīng)修飾，在其 5' 端顯示末端炔烴，熒光團包含疊氮基官能團。獲得了 91% 的產(chǎn)物收率，但在反應(yīng)中沒有使用催化劑，導(dǎo)致 1,4-取代和 1,5-取代的 1,2,3-三唑產(chǎn)物的混合物。如果使用銅催化劑，則很可能僅產(chǎn)生 1,4-取代的三唑，并且反應(yīng)進行得更快。西拉等人。將 DNA 標(biāo)記更進一步，合成了核苷，每個核苷的芳香核堿基上都含有一個末端炔烴。修飾的脫氧腺苷 (dA)、脫氧鳥苷 (dG)、脫氧胞苷 (dC) 和脫氧胸苷 (dT) 均包括在內(nèi)。使用固相合成，隨后合成了幾種寡核苷酸，其中含有一種修飾的核苷、兩種或根本不含（作為對照）。寡核苷酸及其雙鏈體的特性不受修飾的核苷的顯著影響，與對照相比時相似的解鏈溫度證明了這一點。然后通過點擊化學(xué)將含有疊氮基官能團的報告分子與修飾的堿基綴合。結(jié)合后，報告分子開始發(fā)出熒光，表明寡核苷酸已被成功標(biāo)記。如果商業(yè)化，Seela 的修飾核苷可以使寡核苷酸標(biāo)記變得微不足道。

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