1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
 

　　倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
 

　　每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH=7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
 

　　按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）
 

　　每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。
 

　　裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）
 

　　于4℃下12000 rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于-20℃保存。

 

　　
 

　　2.組織中總蛋白的提取
 

　　將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
 

　　加400μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
 

　　幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
 

　　裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。
 

　　加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。
 

　　
 

　　3.培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取
 

　　將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500 rpm離心5min。
 

　　棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
 

　　用槍洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
 

　　將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。