2023年9月12日，中國科學院深圳先進技術研究院李漢杰課題組聯合深圳市寶安區(qū)婦幼保健院、深圳大學、上海交通大學和復旦大學等單位在Cell（IF=57.49）發(fā)表了研究論文：An immune cell atlas reveals the dynamics of human macrophage specification during prenatal development。 該研究通過構建人類產前免疫細胞發(fā)育的時空動態(tài)圖譜，揭示了多種巨噬細胞亞型在發(fā)育過程中的分化起源、空間定位、功能特征及轉錄調控機制。

重大貢獻：

1. 突破性的發(fā)現了一群在轉錄組、特征蛋白表達、和形態(tài)上與中樞神經系統中的小膠質細胞類似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類小膠質細胞（Microglia-like cells）。它們是早期表皮中的主要免疫細胞群，沿背-側-腹軸呈極化分布。這群類小膠質細胞可以與神經嵴細胞相互作用，并調節(jié)其向黑色素細胞的分化。

2. 清晰的鑒定了一群廣泛分布的促血管生成巨噬細胞（Proangiogenic macrophages, PraM），它們駐留在多個器官的血管周圍。這些促血管生成巨噬細胞與小膠質細胞均從起源于卵黃囊的巨噬細胞前體分化而來。

3. 構建了橫跨「18個發(fā)育階段」、「19種組織」的人類胚胎免疫系統發(fā)育高分辨率圖譜。為研究人類巨噬細胞的異質性和發(fā)育提供了一個高分辨率的時空動態(tài)圖譜，有助于理解其在發(fā)育過程中的不同作用。研究團隊還開發(fā)了一個專門的數據庫（119.8.233.169），方便共享數據，促進研究成果的共同探索和領域發(fā)展。

巨噬細胞幾乎分布于全身每一個部位。巨噬細胞高度異質性，主要表現在形態(tài)、定位、基因表達譜及功能等方面，這些表型由巨噬細胞的發(fā)育起源（先天）和駐留的微環(huán)境所（后天）決定。具有組織特異性特征的巨噬細胞包括中樞神經系統的小膠質細胞（Microglia）、肝臟的枯否細胞（Kupffer cells）和表皮的朗格漢斯細胞（Langerhans cells）等。還有一些分布于多個器官的巨噬細胞，如血管周圍巨噬細胞（Perivascular macrophages）?；趪X類動物（尤其小鼠）的研究結果，學術界對巨噬細胞亞型的多樣性、發(fā)育起源以及組織特異性的形成有了一定的共識。但是，這些發(fā)現是否適用于人類仍是一個未知數。

研究團隊對來自受孕后4-26 PCW（Postconceptional Week，PCW）囊括19種人類胚胎組織樣本的免疫細胞進行了單細胞轉錄組測序，獲得了近30萬個高質量的免疫細胞(見下圖)，并鑒定了11種主要的免疫細胞類型，包括：巨噬細胞（Macrophages）、祖細胞（Progenitor cells）、B 淋巴細胞、T 淋巴細胞、先天淋巴細胞（Innate-like lymphocytes）、自然殺傷細胞（Natural killer cells）、樹突狀細胞（Dendritic cells）、單核細胞（Monocytes）、巨核細胞（Megakaryocytes）、粒細胞（Granulocytes）和紅細胞（Erythrocytes）。在此基礎之上，研究團隊對每一種主要的免疫細胞類型進行了更細致的分類，最終注釋得到56種免疫細胞亞型。

研究人員重點對巨噬細胞進行了研究并將其進一步細分為了15個亞群。通過時空分析，他們發(fā)現在人類胚胎發(fā)育時期，巨噬細胞就已經具有了顯著的組織特異性。在4 PCW左右（器官初形成階段），巨噬細胞前體就已經出現在胚胎以及卵黃囊中并一直持續(xù)到大概8 PCW，直到被成熟的組織駐留巨噬細胞所替代。在這些巨噬細胞中，一部分亞型具有顯著的組織特異性特征，如中樞神經系統中的小膠質細胞，肝臟中的枯否細胞、表皮中的朗格漢斯細胞等。而另外一部分亞型共享于多個組織中，如促血管生成巨噬細胞以及其前體細胞（pre-Proangiogenic macrophages, pre-PraM）。研究團隊還發(fā)現腎上腺中有一群組織駐留巨噬細胞（AXL+, FCGR3A+），睪丸中也存在一群組織駐留巨噬細胞（MMP9+）和一群具有破骨細胞特征的巨噬細胞（ACP9+, SIGLEC15+, MMP9+）。

中樞神經系統之外的類小膠質細胞（Microglia-like cells）

研究人員在胚胎多個外周組織（皮膚、心臟及睪丸）中鑒定出一群和小膠質細胞有相似基因表達譜特征的巨噬細胞。這一發(fā)現打破小膠質細胞只存在于腦及脊髓中的傳統認知。這群細胞高表達P2RY12, TMEM119, SALL1, C3等和小膠質細胞相同的特征基因，并且在無監(jiān)督聚類分析中，這群細胞也和腦、脊髓中的小膠質細胞聚為一類。研究人員因此將這群新發(fā)現的分布在多個外周組織的細胞命名為類小膠質細胞（Microglia-like cells）。流式分析進一步驗證了這群外周組織中的類小膠質細胞與中樞神經系統中的小膠質細胞一樣，都呈現CD45lowP2RY12+MRC1-的表型。此外，基于多重免疫熒光實驗，發(fā)現類小膠質細胞在Carnegie Stages 12（CS12）時期就已經出現在表皮組織中。在14 PCW之前，類小膠質細胞一直是表皮中最主要的免疫細胞，此后細胞比例才開始逐漸減少，在20 PCW之后，基本被朗格漢斯細胞替代。在胚胎心臟中，類小膠質細胞最早出現在CS13的主動脈（aorta）中，并且在26 PCW之前一直是主動脈中最主要的免疫細胞。而成人主動脈組織中則檢測不到這群類小膠質細胞。在胚胎睪丸中，類小膠質細胞最早能夠在CS14的時候被檢測到，主要存在于附睪（epididymis）中的輸出小管（efferent duct）周圍，而在睪丸實質（parenchyma）中比例則較低（圖2）。

表皮和中樞神經系統均起源于外胚層，而主動脈和附睪則起源于主動脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros, AGM）區(qū)域。研究團隊推測，小膠質細胞以及類小膠質細胞的前體從卵黃囊遷移到外胚層和 AGM 區(qū)域，隨后在這兩個區(qū)域獨立分化為小膠質細胞或類小膠質細胞。

表皮駐留的類小膠質細胞呈極化分布，與神經嵴細胞互作并調控其分化

由于類小膠質細胞在表皮中最為豐富，研究團隊進一步研究了它們在表皮組織中的功能。研究團隊發(fā)現，與四肢和腹部皮膚相比，類小膠質細胞在背部和頭部表皮中比例更高。在9 PCW時，背部表皮中幾乎所有的免疫細胞都是類小膠質細胞，而四肢表皮中約60%的免疫細胞是類小膠質細胞。進一步定量分析表明，在胚胎發(fā)育不同階段，背部表皮的類小膠質細胞都比四肢表皮更多，分布更密集（圖3）。

類小膠質細胞在表皮中的極化分布模式與神經嵴細胞（neural crest cells， NCCs）的背外側遷移路線（dorsolateral migration）有類似之處，因此研究人員猜測表皮的類小膠質細胞與NCCs之間可能存在某種互作。NCCs是外胚層衍生的多能干細胞，背外側遷移時可分化為黑色素細胞（melanocytes）。通過多重免疫熒光實驗，研究團隊發(fā)現表皮中的類小膠質細胞和NCCs之間存在直接的相互作用。與之一致的是，研究團隊觀察到類小膠質細胞和黑色素母細胞（melanoblasts）的密度在不同發(fā)育階段沿表皮的背-側-腹軸（dorsal-lateral-ventral axis）逐漸降低。

為了評估類小膠質細胞對神經嵴細胞分化的影響，研究團隊體外培養(yǎng)了來源于胚胎背部的新鮮皮膚組織塊。在胚胎皮膚中用氯膦酸二鈉脂質體巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes清除類小膠質細胞（Microglia-like cells）顯著減少了黑色素母細胞的數量，這提示了類小膠質細胞可能會調控神經嵴細胞向黑色素細胞的分化（圖3）。

廣泛分布于多個臟器中的促血管生成巨噬細胞

研究人員在多個臟器中都鑒定到了一群高表達促血管生成基因（VEGFA, TNF, IL1B, CXCL8/IL8）的巨噬細胞，并且這群細胞在不同組織中都具有相似的基因表達譜。體外成管實驗也證實了這群細胞促血管生成的功能。他們進一步分析發(fā)現，這群細胞在各個臟器中都富集在血管周圍（圖4）。

研究團隊又進一步分析了這群促血管生成巨噬細胞的發(fā)育起源。通過多種擬時序分析算法推斷這群細胞是從卵黃囊起源的巨噬細胞前體分化而來，并且中間經歷了一個相對不成熟的前體狀態(tài)（pre-PraM）。擬時序分析推算出的分化軌跡與細胞的真實采樣時間高度一致，并且其促血管生成信號也在隨之增強。此外，研究團隊用成管的內皮細胞上清液培養(yǎng)來源于卵黃囊的早期巨噬細胞前體，發(fā)現可以誘導出表達促血管生成基因的巨噬細胞。這些結果明確了這群促血管生成巨噬細胞的發(fā)育起源。

總而言之，該研究通過對人類產前階段近30萬個免疫細胞的單細胞轉錄組分析，著重描繪了15種巨噬細胞亞型的時空動態(tài)變化。突破性的發(fā)現了一群在轉錄組、特征蛋白表達、和形態(tài)上與中樞神經系統中的小膠質細胞類似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類小膠質細胞。它們是早期表皮中的主要免疫細胞群，沿背-側-腹軸呈極化分布。這群類小膠質細胞可以與神經嵴細胞相互作用，并調節(jié)其向黑色素細胞的分化。通過功能、空間特征、分化軌跡的研究，研究團隊還細致解析了一種尚未被充分了解的促血管生成巨噬細胞，它們駐留在多個器官的血管周圍。這些促血管生成巨噬細胞與小膠質細胞均從起源于卵黃囊的巨噬細胞前體分化而來（圖5）。該文章為研究人類巨噬細胞的異質性和發(fā)育提供了一個高分辨率的時空動態(tài)圖譜，有助于理解其在發(fā)育過程中的不同作用。